技术领域
[0001] 本发明涉及确定包括UVA和UVB辐射的积分防晒指数（/ SPF或iSPF)的方法， 该积分防晒指数可用于对美容型防晒剂和治皮肤病型防晒剂分类。
背景技术
[0002] 众所周知UV辐射大大增加了皮肤中自由基的产生。产生了活性氧簇，如羟自由基 *0H_、超氧阴离子自由基O2-和单线态分子氧1O2,它们继而会使得形成脂自由基ΙΛ因此，美容型防晒制剂和治皮肤病型防晒制剂含有UV过滤物质，另外还含有少量抗氧化剂。
[0003] 另外，从第22届世界化妆品化学家学会联盟学术研讨会（Edinburgh 2002, Oral Papers, Vol.2, Zastrow et al.)会议出版物以及其它出版物可知：通过电子自旋共振 (ESR)成像已确定UVA和UVB射线可穿透到皮肤的不同深度。波长介于^Onm到320nm之间的UVB射线仅能穿透高达约50 μ m的深度，而UVA辐射可到达下面的真皮层，即深通过在发射一确定量辐射的辐射源和皮肤基质之间放置减少辐射的标准滤光片，可模拟用于评估和校正本发明方法的防晒剂的不同浓度。
[0004] 间，它在下层皮肤的产生主要因为在太阳光谱UVA范围内的辐射，其出现可通过诸如 DMPO (5，5- 二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物，5，5' -dimethyl-1-pyrroline-N-oxide) 或 PBN(苯基叔丁硝酮，phenyl-tert-butylnitrone)等的自旋捕获剂（spin trap)和 ESR 法测量。
[0005] 通常可得到的防晒剂通常其标签上的防晒指数（SPF)或防光照指数 (“lichtschutzfaktoren-LSF)介于2到100之间，优选4到50之间。包含在此的信息是基于使用者认识到：他们可在较长一段时间（即出现红斑（晒伤）所需要的时间乘上各自的指数，以分钟计）内将其皮肤暴露于太阳辐射。根据发明人自己的发现，皮肤变红与自由基的出现不存在线性相关，并且皮肤变红通常被认为是由于某一剂量的UV辐射所产生的炎症（红斑）。另外，防晒剂含有不同量的UVA和/或UVB过滤剂，因此在大多数情况下不能针对自由基提供可适度变化的并且不可量化的保护。时下的SPF/LSF仅与UVB的效果相关，似乎不再适合正确表示防晒剂的防护效果。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供确定积分防晒指数的方法，该积分防晒指数包括UVA和UVB 辐射对皮肤表面和深层皮肤的全部影响，并能作为使用者的正确指导值。
[0007] 根据本发明，确定美容型防晒剂和治皮肤病型防晒剂的包括UVA和UVB辐射的积分防晒指数（f SPF)的方法包括如下步骤：
[0008] (a)将一确定量的防晒剂直接施用于一确定面积的皮肤基质，该皮肤基质事先已由起自旋捕获剂作用的已知物质浸渍；
[0009] (b)通过辐射源如太阳模拟器将皮肤基质暴露于一确定量的辐射，该辐射包括自然太阳暴露条件下的UVA和UVB射线；[0010] (C)暴露后1-120分钟内对所述暴露于辐射的皮肤基质进行电子自旋共振（ESR) 测量；
[0011] (d)与自由基数已知的标准样本相比较后将自由基形成值RG标准化，并将被捕获的自由基数记录为实际数目XX IO1Vlmg样本即RG = XX IO12自由基/mg皮肤样本；
[0012] (e)并根据公式⑴确定所述积分防晒指数f SPF
[0013]
[0014] 其中的含义为提供给使用了防晒产品的皮肤样本的单位为mj/cm2的UV剂量， 用公式（7)进行计算
[0015] E0 = I · t (7)
[0016] I =太阳模拟器辐照度（mW/cm2)
[0017] t =单位为秒的暴露时间；
[0018] 并且E的含义为单位为mj/cm2的有效UV剂量，因此与步骤（b)中形成的自由基的检测量相关
[0019] 并且其中根据步骤（d)中的自由基形成值的实际数目X与公式（2)计算E
[0020] Iog10 (E) = a · Iog10 (X · 1000)+b (2)
[0021] 其中a和b为在采用平方差估算法的校正步骤中所确定的实验参数，其目的是获得UV剂量以10为底的对数函数与自由基形成的实际数目的以10为底的对数函数之间正确的线性关系；
[0022] 并且根据公式⑶计算E
[0023] E = l0logl0(E) (8)。
[0024] 上述步骤（a)中的确定量的防晒剂为例如l-^ig/cm2皮肤表面的量，优选2mg/cm2。 所使用的皮肤样本从例如活检皮肤、皮肤基质（人造皮肤）或猪皮中获得，猪皮优选来自体外处理的猪耳的皮肤块。上述皮肤样本在下文中被称为“皮肤基质”或“基质”。防晒剂直接施用于基质表面。
[0025] 首先，例如通过孵育样本将自旋捕获剂特别是PBN施用于基质上以形成稳定的、 可长时间检测的加合物。
[0026] 使用自旋捕获技术研究活检皮肤暴露到光线时形成的自由基/R0S(R0S =活性氧簇）。该技术一般涉及将具有活性、寿命较短的自由基加成至反磁性“自旋捕获剂”的双键以形成稳定得多的自由基“自由基加合物”。通过形成可通过ESR技术测量的自旋捕获剂加合物（其寿命为几分钟至几小时），自旋捕获剂的使用延长了甚至活性强的自由基/ROS 的寿命（10_9s-10_3s)，如羟自由基ΓθΗ_)、超氧阴离子自由基（02_)和脂自由基（L*)。优选的自旋捕获剂是ΡΒΝ(苯基叔丁硝酮），它可在较长一段时间内（约60分钟）内提供极为稳定的ESR信号，因此特别适合对暴露于不同UV剂量后皮肤中所形成的自由基进行定量。该试剂购自Sigma Munich Germany。与PBN的反应如下进行：
[0027]
[0028] 在UV辐照前用自旋捕获剂溶液将基质浸渍如30分钟。自旋捕获剂PBN溶于如水 /乙醇（50/50)溶液，得到的浓度为400mM。
[0029] 然后，基质表面用如水/乙醇冲洗并干燥，并在较短一段休息期后将预定量如 2mg/cm2的防晒剂直接涂抹在基质上。
[0030] 将基质静置5-60分钟，优选10-15分钟，并且优选地，根据步骤（b)将从基质上取出的一块皮肤暴露于来自太阳模拟器的辐射，UVA范围为17. 53mff/cm2,UVB范围为0. 37mff/ cm2。上述参数基本符合自然的太阳暴露条件。1-120分钟后通过ESR光谱法进行测量。
[0031] 与光学法如荧光法或化学发光法相比较，ESR光谱法的一个重要优点在于所使用的电磁波在生物组织中的穿透深度。ESR波长约为其它技术的IO5倍，这使得它在人组织中的穿透深度约为10mm。对直到真皮下层的全部皮肤研究可不受到干扰。该测量范围在检测甚至在全部皮肤深层的UV辐射的效果非常有意义。这个性质决定了 ESR光谱法可用于防晒指数的评估。但是，若没有自旋捕获剂，从ESR信号强度直接计算可使得防晒指数被低估。
[0032] 暴露于辐射与测量之间的时间取决于自旋捕获剂和自由基所形成的加合物的有限寿命。优选地，它为1-90分钟。
[0033] 自旋捕获剂PBN的优点在于加合物的高度稳定性，这使得可进行定量分析；以及较高的信号反应，这是由于其在不同类型的被捕获自由基如以羟基或碳原子为中心的自由基之间没有选择性。所有被捕获的自由基的信号形状相同，并获得了较高的峰强度。
[0034] 通过PBN加合物的峰峰信号幅度（低场峰）对所形成的自由基进行定量。以自由基数已知的校正样本（标准品）的幅度对信号幅度进行标准化。该标准化是计算RG值（自由基形成值=RGV)的基础。RGV描述了被捕获的自由基数，以实际数目XX IO12 (标准化为 Img被测样本（皮肤））的形式表示，意味着体积单元为Imm · Imm · Imm,并假设人的皮肤密度为1、厚度约为1mm。
[0035] 通过在发射一确定量辐射的辐射源和皮肤基质之间放置减少辐射的标准滤光片， 可模拟用于评估的防晒剂的不同浓度和本发明方法的校正。
[0036] 所使用的优选的减少辐射的滤光片为衰减因子为1、2、5、10和20的中性密度滤光片（Lot Oriel France) 0中性密度滤光片由熔融二氧化硅基质构成，在其中可实现薄层金属的真空沉积。包被厚度决定了光密度。吸光度几乎与UV波段的波长O90-400nm)无关， 并且与美容标准品的正确使用模式无关。
[0037] 所有已知防晒剂（UV过滤剂）均可用本方法测量，例如4-氨基苯甲酸衍生物、 肉桂酸酯（ester of cinnamatic acid)、亚苄基樟脑衍生物、二苯酮衍生物、甲氧苯甲酰甲烷衍生物等。这些防晒剂含有如二苯酮_3、二苯酮-4、甲氧基肉桂酸辛酯、胡莫柳酯 (homosalate)、苯基苯并咪唑磺酸、甲氧基肉桂酸乙基己酯、对甲氧基肉桂酸异戊酯、乙基己基三嗪酮、二乙基己基丁胺三嗪酮（Diethylhexyl ButamidoTriazone)、4_甲基亚苄基樟脑、PABA、乙基己基二甲基PABA等。同样，物理性过滤剂如TiO2、加0、ZrO2等也可得以检测。 例如，下列UV过滤剂（有缩写形式）可根据本发明的方法进行检测。
[0038] ES =水杨酸乙基己酯；OC =氰双苯丙烯酸辛酯；IMC =对甲氧基肉桂酸异戊酯； BMDBM = 丁基甲氧基二苯甲酰甲烷；MBBT =亚甲基-双-苯并三唑基四甲基丁基苯酚（以 50%水分散系形式提供）。后者的商品名为“Tinosorb Μ”。BEMT =双乙基己氧基苯酚甲氧基苯三嗪。后者的商品名为“Tinosorb S”。
[0039] 不同防晒剂的UV吸收光谱可使用LabsphereUV 1000S透射分析仪，通过光谱法 (Cosmetics and Toiletries,Vol. 118,n° 10,0ctober2003)实现。将防晒剂样本以 1. 2mg cm-2涂抹在透明的粗糙化的PMMA盘上。根据COLIPA防晒指数测试方法（SPF测试方法。 Colipa参考号：94Λ89(1994))测定体内SPF。使用持续性色素沉淀指数（PPD)作为治疗指标(end point)测定体内 UVA 防晒指数(Photodermato 1. Photoimmcrnol. Photomed. 16， 245-249(2000)。
[0040] 本发明的方法先考虑到：与全部UV作用相关的任何皮肤损害的原因在于所产生的自由基的总数。该数取决于全部UV剂量而非UV射线强度。所产生的自由基的总数可使用ESR准确测量，并确定积分SPF，这提供给使用者免受UV辐射的实际程度方面的正确信肩、ο
[0041] 该SPF在两种意义上被积分：它包括全部UV光谱以及达到皮肤能被UV辐射损害的整个深度。
[0042] 另一优点在于：可使用2到4块皮瓣或直接在猪皮上以相同甚或提高的可靠性测量iSPF(ISPF或/ SPF)，所述皮瓣被测得每块为1cm2，获自人的皮肤外科手术或皮肤基质 (人造皮肤），而无需在待测人在受伦理质疑的辐射暴露后测量其皮肤的红斑的出现情况。 这样，不再存在由于辐射引起的对待测的人的皮肤的损害，因为新的测量方法根本不需要待测的人。根据COLIPA标准方法，需要10-20位志愿者。另外，避免了获得结果前较长的等待时间的后果，并且无须确定在已知方法中需要的作为用于评估的参照物的某些标准品。
[0043] 从设备以及方法上来看，新方法大大降低了费用，这是由于现在的RGV测量方法仅需要确定SPF的常规方法所需要的费用的一半或三分之一。
[0044] 另外，iSPF(ISPF或/ SPF)可被测量和计算，准确度约为士 10%，而对于在不同检测机构测量的高SPF而言，常规SPF测量方法即COLIPA(UVB防护)的准确度只有士 20-25 %，甚至为 30-50 %。
[0045] 现有的PPD方法相当复杂，并且在用于黑色皮肤类型时相当不准确，即这方面的改进将拓宽现有方法的范围，并且会得到更为可靠的结果。本发明的方法不依赖于皮肤类型，并且不依赖于种族皮肤的颜色。
[0046] 本发明的方法的另外一个优点在于仅需要不太复杂的设备。用于将较大的皮肤表面暴露于UV辐射的大表面照明系统可用较小的、更有效的点状辐射单元代替。
[0047] 使用校准的电子自旋共振（ESR) X波段分光光度计，采用ESR对在UV辐射活检皮肤时所形成的自由基进行检测。分光光度计为ERS 300+(ZffG Germany，并由Galenus Germany改进），使用如下分光光度计设置：微波频率& = 9. 52GHz，微波功率Py= 20mff, 调制频率fm = 100kHz，调制幅度Bm = 0. 2mT,磁场扫描Δ Bs = 20mT,扫描时间ts = 60s。[0048] 可能有用的还有如下分光光度计设置：微波功率P μ = lO-lOOmff,调制幅度to = 0. 05-0. 5mT，磁场扫描 ABs = 5_20mT，扫描时间 ts = 10_120s。
[0049] 待测美容制品或药物制品也可掺入本领域已知的所有抗氧化剂分子或自由基清除分子。这些物质包括维生素，如维生素C及其衍生物如抗坏血酸乙酸酯、抗坏血酸磷酸酯和抗坏血酸棕榈酸酯，维生素A及其衍生物，叶酸及其衍生物，维生素E及其衍生物如醋酸维生素E ；超氧化物歧化酶；黄酮或类黄酮；氨基酸如组氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸及其衍生物；类胡萝卜素和胡萝卜素如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素；尿酸及其衍生物；α-羟基酸如柠檬酸、乳酸、苹果酸；均二苯代乙烯及其衍生物等。
[0050] 待测制剂的其它优选的抗氧化剂是具有高自由基防护指数的活性物质，该活性物质含有对破斧盾籽木（Quebracho Blanco)的树皮进行提取并进行一系列酶解所获得的产物，该产物含有以重量计至少90%的原花色素寡聚物和以重量计高10%的没食子酸，并且与微囊连接；该活性物质还含有通过提取获得的蚕的提取物，该提取物含有杀菌肽、氨基酸和维生素混合物；该活性物质还含有非离子、阳离子或阴离子水凝胶或水凝胶的混合物； 该活性物质还含有一种或几种磷脂以及水。该复合物（complex)制剂中还含有酵母的超声裂解产物，该裂解产物含有至少150单位超氧化物歧化酶/ml，以及一种或多种环糊精。 该复合物制剂可为W099/66881实施例1或2、或WO 01/26617实施例1中的产物。优选还有醇溶液中的植物提取物的活性复合物作为抗氧化剂。该复合物含有以重量计0. 1-2%的绿色咖啡豆提取物、以重量计0. 1-2%的茶（Camellia sinensis)的叶提取物、以重量计 0. 1-2%的水黄皮（Pongamia pinnata)提取物以及以重量计0. 1-2%的欧白芷（Angelica archangelica)的根部提取物，并用一种C2-C5单价醇补足100%。
附图说明
[0051] 本发明将在下列实施例中详细描述。附图为：
[0052] 图1防晒指数测定的示意图
[0053] 图2RG数据（XX1012，来自表1)对UV剂量
[0054] 图31og(UV剂量）和log(自由基形成）的线性关系，根据图2的数据
[0055] 图4防晒剂E、N、G和H的UV光谱
具体实施方式
[0056] UMl丨量禾Π自由基形成(RG)之_丨、_勺关系
[0057] 通过使用未过滤的UV源（衰减因子为1)和衰减因子为2、5、10和20的中性密度滤光片过滤的UV源实现了对活检皮肤提供不同辐照强度。它们被放置在UV源和活检皮肤之间，恰好在样本支持器的开口处。中性密度滤光片以相同因子衰减了所有波长的射线。 使用了五个不同辐照时间：30、60、150、300和600秒。就非衰减UV源而言，这对应于自然太阳暴露的约1. 7,3. 5,8. 7,17. 4和34. 8分钟。这同样对应于0. 11,0. 21,0. 54,1. 07和 2. 14MED。
[0058] 首先检查是否遵守反比定律。这意在表明所形成的自由基水平仅依赖于剂量，而非使用时间。这是另一计算真实的防晒指数的先决条件。
[0059] 选择辐照时间以获得与中性密度滤光片衰减度相关的剂量级数（Progression)。例如，米用二倍于《减度1分析（t = 30秒）的暴露时间（t = 60秒）可实现《减度2分析。因此，可使用不同辐照时间提供相同的UV剂量。
[0060] 这在表1中示出，其中报道了根据不同的暴露时间以及不同的光衰减度，由UV引起的自由基的测得量（RG = XX IO12自由基/mg)。通过公式（6)计算UV剂量（mj/cm2)(未
在表1示出）
[0061]
[0062] I =太阳模拟器辐照度（mW/cm2) ；t =暴露时间（s)；
[0063] Att =中性密度滤光片衰减度
[0064] 根据五次辐照时间：30、60、150、300和600秒，以及五种衰减因子1、2、5、10和20，
沿着表1的对角线（从左上角到右下角)可获得恒定UV剂量（537mJ/cm2)。若反比定律是有效的，应该可测得等量的自由基。
[0065] 这在沿着该全部时间范围基本恒定的自由基形成中可观察到：RG平均值= 1. 36 · IO12自由基/mg活检皮肤，相对标准差较低，对于这五个值仅为7. 03%。
[0066] 在表1的几个小斜线中还可发现对应不同重复UV剂量的其它恒定RG值。它们通过专门的阴影/点被标注出来。
[0067] 因此，表1证明在较大范围的UV剂量内反比定律相当适用。
[0068] 表1根据不同滤光片衰减度和不同辐照时间在活检皮肤上测得的RG值 (X · 1012rad/mg)。
[0069]
[0070] 其次，还研究了 UV剂量和自由基形成（RG)之间的关系。
[0071] 通过4种中性密度滤光片以及未过滤的光源乘上五种不同辐照时间，可提供25种不同UV暴露，对应13种不同的UV剂量（参见表1)。[0072] 根据UV剂量，皮肤中的自由基形成被绘成图2。尽管暴露时间不同，我们注意到所有单次实验数据图非常好的聚集在一起并分布在一条曲线周围。无论考虑哪一种暴露时间，根据非线性关系可将图联系起来。这明显是反比定律适用性的结果。自由基形成对UV 剂量的图表明对较高UV剂量存在饱和。
[0073] 但是，采用双对数刻度，简单线性函数可与实验作图相重叠，这使得非常容易校正本方法。该陈述在图3的图中示出，其中用log UV剂量对log RG作图。本研究中，为避免由于对数函数转化所得到的负的数据，RG数据的实际数目X乘上了因子1000。
[0074] 根据通过小二乘法（the least-square error method)对参数a禾口 b简单的数字调整，采用这些实验数据下面的线性函数获得了良好的相关性。
[0075] log (UV 剂量）=a · log (1000 · X) +b (2b)
[0076] 该关系（与图3的关系相反）可计算与在涂抹防晒产品的活检皮肤中检测到的自由基（RG)的量相关的UV剂量。
[0077] 防晒指数的测定
[0078] 上述实验结果可开发一种确定防晒指数的方法。它们被计算为通常所使用的UV 剂量的比率。图1示例性描述了该方法，其中：
[0079] -E0为用于全身防护层/活检皮肤的UV剂量。
[0080] -E为通过校正过的公式2、从通过ESR光谱法测量得到的自由基数X获得的UV剂量。该“有效”UV剂量应提供给未受保护的活检组织以产生与在受到保护的活检组织中测得的量相同的自由基，在该受保护的活检组织上涂抹了 2mg/cm2防晒层。
[0081] 表2含有以该方法为基础的防晒指数，该方法采用了表1获得的数据以及图3报道的公式2的参数值。它们与作为参照物的中性密度滤光片的衰减值相比较。每一个计算得到的防晒指数为对应不同辐照时间的五个值的平均值。中性密度滤光片的衰减度和计算得到的防晒指数非常接近。
[0082] 表2 ：中性密度滤光片的防晒指数的计算，来自表1所报道的RG数据
[0083]
[0084]积分 SPF
[0085] 上述UV剂量和RG值之间的关系使得可以用与体内SPF相似的方式计算防晒指数。通过使用中性密度滤光片作为标准防护层可验证这些新的防晒指数的有效性。
[0086] 因此，使用与测定体内SPF相同的方法，其中：
MED
[0087] 定义：就红斑治疗指标而言，
[0088] 在此，MEDp =用于受到保护的皮肤的小红斑UV剂量
[0089] MEDu =用于未受到保护的皮肤的小红斑UV剂量。
[0090] 根据模式描述（图1)，在红斑治疗指标被通过ESR光谱法法检测得到的自由基RG 的量所替换时，MEDp和MEDu现在对应和E。
[0091] 通过ESR X波段光谱法对自由基进行定量测量可确定新的防晒指数。然而，ESR光谱法的穿透深度更深，使得可对皮肤进行全面研究，包括UVB和UVA的全部范围以及从表面直到皮下组织的皮肤。之后我们将该新的防晒指数命名为积分防晒指数（iSPF、ISPF或 f SPF)。
[0092] / SPF 的测定
[0093] 图1示出了基本方式。进行如下步骤：
[0094] (1)建立了 UV剂量和自由基形成（RG)之间的数量关系（估算公式2的a禾Π b参数）。通过测量接受到不同UV剂量的未防护的活检组织中的自由基形成，时常调整（校正） 这两个公式参数。
[0095] (2)对受到保护的活检组织（ang/cm2防晒产品涂抹在表皮表面）进行辐照。通过 ESR光谱法对每个暴露时间（t)的自由基形成进行估算。因此，受到保护的活检组织的RG 值=)(t(测量值）。
[0096] (3)用下列公式计算每个暴露时间用于受到保护的活检组织的相应UV剂量（Etl) t ：
[0097] (Etl)t =辐照度•时间 （3)
[0098] (4)根据公式2的a和b参数，计算形成相同量的自由基（Xt)所需要的有效UV剂
量
[0099] Iog(E)t = a · log(1000 · Xt)+b (2a)
[0100] (5)防晒产品的积分SPF计算为相同暴露时间的UV剂量的比率：
[0101]
[0102] 实施例1和2
[0103] 测试了两种不同防晒剂样本，均在UVB获得了较高的保护，并且获得了不同的UVA 保护水平：防晒剂A为物理防晒剂TiO2, SPF为26，UVA PF(PPD) = 5 ；防晒剂B为UV过滤有机防晒剂，SPF 为 39，UVA PF(PPD) =12。
[0104] 两种产品均以ang/cm2用于皮肤表面，并根据三次辐照时间进行测试。同时还平行测试了没有涂抹防晒剂的活检皮肤，一组直接暴露于太阳模拟器，第二组通过衰减度为30 的中性密度滤光片暴露。表3所报道的每一种自由基形成数据为四个活检组织的平均值。
[0105] 表3 ：不同辐照时间的自由基形成
[0106] (RG = X · IO12 rad/mg)
[0107]
[0108] 在步中，再次建立自由基形成（Xt · 1000)和UV剂量之间的关系，以检测其可重复性。在有和没有中性密度滤光片的情况下，使用了没有涂抹防晒剂的活检皮肤。根据公式（6)计算这些活检皮肤所获得的UV剂量。
[0109] 若校正数据被绘成双对数XY轴，可获得准确的如下列公式（5)的公式（2)参数：
[0110] Log (UV 剂量）=2. 0947 · log(1000 · X)-3. 7463 (5)[0111] 可注意到公式（5)与图3所示出的线性关系非常接近。
[0112] 通过对数函数（以10为底）转化表3的所有数据，以获得线性关系：
[0113] 表 3a
[0114]
[0115] 然后通过公式2校正log (自由基）对log (UV剂量）：
[0116] 表北
[0117] a和b参数调整
[0118]
[0119] 然后确定a和b值以小化总方差Delta2。因此用a = 2. 0947和b = 3. 7463调整公式2以适合实验值。调整之后，公式2被用于获得不同X值的Log Ε。
[0120] 可从表3的自由基形成数据计算UV剂量，它们在表4中被报道。首先通过将计算得到的UV剂量和空白组和中性密度滤光片30所使用的UV剂量相比较检验计算方法。仅观察到微小差异，大偏差为13%。然后，计算了防晒产品A和B的有效UV剂量。这些UV 剂量应提供给未受保护的活检组织以产生与在受到保护的活检组织中测量得到的量相同的自由基，在该受保护的活检组织上以ang/cm2涂抹了防晒层。
[0121] 表4 ：根据表3的自由基形成数据由公式（5)计算得到的UV剂量（mj/cm2)
[0122]
[0123] 根据表4的UV剂量，防晒指数（/ SPF)被计算为在相同暴露时间里所使用的UV 剂量与计算得到的（有效的）UV剂量之间的比率。结果在表5中报道。用空白组和中性密度滤光片30分析检验指数的准确度。同一表的第4和5列报道了新的防晒剂防晒指数。
[0124] 还计算了所有测量的不确定度（士95%置信区间）（每个暴露时间有4个活检组织）。
[0125] 表5 ：计算得到的防晒指数/ SPF，以表4报道的UV剂量的比率为基础。[0126] f SPF
[0127]
[0128] 作为个观察到的现象 broadness) ±曾力卩。在体内UVA(PPD)为,积分SPF明显低于体内红斑SPF。
[0129] 实施例3-8
[0130] 为确定积分SPF对不同UV过滤宽度的选择性，用不同UVB和/或宽波带UVA/B过滤剂得到了专门的防晒制剂。
[0131 ] 实施例3 =防晒剂C = O-W基底，没有UV过滤剂
[0132] 实施例4 =防晒剂D =基底+UV过滤剂1 (5 % IMC)
[0133] 实施例5 =防晒剂E =基底+UV过滤剂2 (10% IMC)
[0134] 实施例6 =防晒剂F =基底+宽波带UVA/UVB过滤剂1 (1，5 % BMDBM+3 % BEMT)
[0135] 实施例7 =防晒剂G =基底+宽波带UVA/UVB过滤剂2 (3 % BMDBM+8 % MBBT+2 % BEMT)
[0136] 实施例8 =防晒剂H =基底+UV过滤剂1 (5 % IMC) +宽波带UVA/UVB过滤剂2 (3 % BMDBM+8% MBBT+2 % BEMT)
[0137] 在三种不同辐照时间30、60和150s如上述的那样测试这六个防晒剂样本。
[0138] 表6报道的每一个自由基形成数据为4个活检组织测量值的平均值。
[0139] / SPF (积分SPF)被计算为在相同暴露时间里所使用的UV剂量与有效UV剂量之间的比率（公式1)。每一个所报道的f SPF为对应不同辐照时间的3个计算值的平均值。 还计算了不确定度（士95%置信区间）并在表6中报道。
[0140] 表6 ：不同辐照时间的RG数据（RG = XX 1012rad/mg)。三次不同暴露时间里计算得到的平均/ SPF。
[0141]
[0142] 上述实施例证实/ SPF随着UV过滤宽度和强度明显增加。没有良好平衡的UVB/ UVA防晒剂不能获得更好的保护效果。这在UVA过滤较弱的防晒剂如D和E中清楚地观察到，在这类防晒剂中仅掺入了 UVB过滤剂。对这些产品而言，针对UV辐射的真实的生物相关防护（用/ SPF表示）相对于表示为红斑SPF的假定值而言显著降低。
[0143] 实施例9
[0144] 与体内PPD和体内SPF相比较，/ SPF考虑了全部太阳UV光谱：UVB+UVA。
[0145] 另一方面，ESR(在皮肤的深处）的这些测量效果可引起对由UVB所形成的自由基进行定量的值的误解。如可能示出的那样，该值约为0. MXlO12自由基/mg。但是，所有这些ROS被包含在ImmX ImmXO. 05mm的体积单元（假设平均表皮为50微米）中。因此，在 UVA的影响下，在表皮中形成的自由基的数目为皮肤的深层中的3倍，约为1.58X1012自由基 /mgo
[0146] 由UVB单独在表皮体积单元中形成的约4. 8X IO12自由基的这些数量可能与生物效应如红斑或相关的DNA损害的形成密切相关。首次指示表明UVB引起的DNA损害可用非常高剂量的抗氧化剂预防。Lin&al报道了在猪皮上测得的通过维生素C和E的组合针对胸腺嘧啶二聚体形成的保护作用。
[0147] 为完成这些实验，将仅对UVA有良好防护的防晒剂加入样本池。将5，0% BMDBM掺入美容型基底，获得在UVA吸收较强、在UVB吸收较差的样本（防晒剂N，图4)。正如期待的那样，测得了较低的体内红斑SPF = 4. 7(士 1. 3)。对积分SPF产生的疑问是：由于我们的皮肤模型对UVB辐射可能缺少敏感性，该积分SPF是否会过分转化成非真实的较高值？将该新方法用于产品N，我们得到与体内SPF相当的积分SPF:/ SPF = 5.1(士 1.2)。因此，即使是在相同产品上实现较低UVB防护和较高UVA防护时，也未出现对UV防护的过高估计， 如图4所示。
[0148] 相反，用体内SPF可能出现任何相关性。
[0149] 依赖于UV过滤制剂，体内SPF数据大大大于该积分SPF (若防晒剂UVB防护较强） 或与之相等。当然，红斑SPF并不考虑UV过滤宽度的重要性，因此会带给消费者主要对于较高SPF值的错误的安全感。从这点来看，新的/ SPF提供了有价值的信息。图4的图总结了 4种典型的实例，示出红斑SPF和积分SPF之间的主要区别：防晒剂E，防护UVB，不防护UVA ；防晒剂N，防护UVA，少量防护UVB ；防晒剂G，对UVB和UVA的防护基本相同；以及防晒剂H，对UVB的防护高于对UVA的防护。
[0150] 光谱和防晒指数表明红斑SPF对UVB过滤非常敏感，而对UVA过滤非常不敏感。相反，本发明的/ SPF对UVB和UVA过滤均很敏感。
[0151] 根据本发明的方法，清楚的是仅有较宽UVB/UVA过滤的产品能获得较高的积分 SPF0这与下述事实相一致:UVA和UVB辐射参与到在全部活检皮肤（表皮+真皮）中形成自由基。另外，由ESR光谱法得到的该新的防晒指数很好地包括了来自UVB的红斑的出现， 并且正如所示出的那样，与体内UVA PPD密切相关。
[0152] 积分SPF可如常规体内UV指数那样被解释：
[0153] / SPF= 10防护意味着：一个人可在太阳下停留十倍于皮肤未受防护时所停留的时间，而不会被晒伤，也不会显著少于出现PPD反应所需要的时间。因此，使用f SPF = 10 的产品后，在太阳下持续暴露1小时可使得皮肤受到自由基的损害较少，这相当于未经保护直接暴露于太阳下的6分钟。
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